细胞培养操作规程，供参考
一．培养基及培养冻存条件准备：
1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

实验操作步骤：  公司产品仅用于科研，不得用于临床．
a．采用认可的方案处死啮齿动物。    
b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。  
c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。   
d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。   
e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。   
f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

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冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ （-20 ℃30 分钟*） → -80 ℃16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

实验材料： 
1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 
2. 100ml灭菌烧杯2个； 
3、50ml离心筒2个 
4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个 
5、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个 
6、细胞计数板1块； 
7、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； 
8、酒精灯1台；
细胞培养的优点：
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。
2.研究条件可以人为控制
pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，可以根据实际需要进行人为的控制，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
3.研究的样本可以达到比较均一性
通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。
4.研究内容便于观察、检测和记录
采用各种研究技术：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备 
记录方式可采用摄影照片、缩时电影、电视等多种手段。
5.研究的范围比较广泛
应用的学科领域较为宽广，如细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等；
适用的对象范围广，从低等动物到高等动物，一种动物的不同年龄阶段以及不同组织，都可进行有针对性的研究。
6.研究的费用相对较经济
可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。

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细胞冻存：
对培养的细胞进行冻存的最佳方法是将细胞置于含有(DMSO)等冷冻保护剂的*培养基中于液氮中储存。冷冻保护剂可降低培养基的冰点，并可减缓冷却速度吗，大大降低冰晶形成的危险  (冰晶可损伤细胞，导致细胞死亡)。
注：DMSO 可促进有机分子进入组织。操作含DMSO的试剂时，应采用与此类物质安全危害相适应的设备和操作规范，并应按照当地法规处置此类试剂。 
细胞冻存指导原则
冻存细胞系以备将来之用时，必须遵守以下原则。与其他细胞培养操作一样，我们建议您严格遵守您所用细胞系附带的操作说明，以便获得最佳结果。 
1）在高细胞浓度情况下进行培养细胞的冻存，并且细胞传代次数尽可能少。确保冻存前活细胞百分比至少为90%。请注意最佳冻存条件取决于所用细胞系。 
2）细胞应缓慢冷冻，可使用可控制降温速度的低温冰箱或者低温冷冻容器使温度每分钟大约降低1°C。
3）必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有 DMSO 或者甘油等冷冻保护剂
4）将冷冻的细胞于 -70°C 以下温度储存；温度高于 -50°C 时，冷冻的细胞将开始变质。 
5）必须使用无菌冻存管储存冷冻的细胞。装有冷冻细胞的冻存管可浸于液氮或者在液氮上方的气相空间内保存 
6）必须穿戴个人防护设备。 
7）所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。必须采用正确的无菌技术，并且在层流通风橱内进行。

实验操作：
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%麻醉，75%酒精浸泡，无菌条件下迅速取出大鼠主动脉。
3、材料预处理：将获取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反复洗涤，去除血管外部的洗涤液澄清，用无菌镊子剥去外膜面的残留组织。PBS洗涤净。
4、除去内皮细胞：将血管纵向剪开， 内膜面向上，无菌镊子沿中轴方向反复刮动内膜层4-5遍，去掉内皮细胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次。
5、分离中膜：将去掉内膜的血管，继续刮动分离中膜，去掉外膜，用眼科剪将内膜剪碎为1×1mm3的小块，加入1 × PBS （pH 7.4 ），转移到15ml 离心管中，PBS洗涤3次，离心收集沉淀物。
6、消化：在洗净的内膜碎块中加入消化酶液，将离心管放入37℃水浴消化15min。
7、终止消化：吸出消化液入新的离心管中，按1：1加入消化终止液，中止酶反应；余下的组织继续加入消化液，消化15min ，重复消化3次。
8、收集重悬细胞：收集中止后的消化液于离心管中，1000 rpm，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬，染色计数细胞。
9、培养细胞密度：调整细胞密度以5 × 105个/ml 接种入培养瓶。
10、培养：放置于37℃，5% CO2培养箱中。
M4e细胞，人喉癌细胞 人脑胶质细胞株(正常),HEB细胞 中国仓鼠卵巢细胞(亚系克隆);CHO-HCV-NS5A5′-CDP，2Na5-胞嘧啶核苷二嶙酸二钠盐1克BR，99%

Ca Ski(人上皮细胞) 5×106cells/瓶×2邻基本同 2'-Mqthylccqtophqnonq 277-16-

FCAR Others Human 人 FCAR / CD89 人细胞裂解液 (阳性对照) 2-Nonanoll庚基甲基5克CP，98%

tTA基因修饰的小鼠畸胎瘤细胞(B类);F9-CAG-tTA-3A1L-LYSINEMONOHYDRATEL-赖酸,一水蛋白组学级500G39665-12-8COLD

HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/Hubei/2011) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) 17832-28-91，49,4-putene7iol vinyl
小气道上皮细胞生长添加物SAEpiCGS脱水长春碱（标准品）Anhydrovinblastine质量规格：HPLC≥95%，标准品

MIF Others Human 人 MIF / GLIF 人细胞裂解液 (阳性对照) 长春新碱（标准品）Vincristine质量规格：HPLC≥98%，标准品

CRFK 猫肾上皮细胞硫酸金雀花碱；硫酸司巴丁（标准品）Sparteine sulfate质量规格：HPLC≥98%，标准品

T-111B木瓜蛋白酶(含100mL酶解缓冲液)10mL高乌甲素（标准品）Lappaconitine质量规格：滴定法≥98%，标准品

HET-1A, 人食管上皮细胞番茄红素（标准品）Lycopene质量规格：HPLC≥90%,标准品,充氮气保护
人卵巢上皮细胞癌细胞脑静脉血管平滑肌细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)N-叔丁氧羰基-L-甲硫氨酸BOC-L-Mine质量规格：>98%,BR

RBP4 Others Canine 狗 RBP4 人细胞裂解液 (阳性对照) BOC-L-丝氨酸N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-serine质量规格：>99%,BR

大鼠心肌成纤维细胞*培养基 100mLBOC-L-苯丙氨酸Boc-L-phenylalanine质量规格：>98.5%,BR

35.1杂交瘤细胞抗CD2 35.1 hybridoma cells against CD2 RPMI-1640(GIBCO)+10%FBSBOC-甘氨酸Boc-Glycine质量规格：>98%,BR

IFNA5 Protein Mouse 重组小鼠 IFNA5 / IFNaG 蛋白 (His 标签)BOC-L-异亮氨酸Boc-Ile-OH质量规格：>98.5%,BR

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二． 细胞处理：
1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

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公司细胞现货供应，质量有保证、*、实验效果好，我司为您提供免费代测服务，同时提供最新价格、说明书、规格、用途、实验原理等相关操作说明。公司产品仅用于科研，不得用于临床．

注意事项：
1.收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
2.收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。
3.由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于7天。
4.所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
腺苷酸环化酶9抗体

细胞培养方法：
1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

WPMY-1人正常前列腺基质永生化细胞 WPMY-1 of normal human prostate somal immortalized cell DMEM+5%FBSFmoc-D-Leu-OHN-芴甲氧羰基-D-亮酸5克特，99%

VEGFC Protein Human 重组人 VEGF-C 蛋白 (His 标签)溴代烷 Bromoqthcnq

小鼠条纹神经细胞(MN-s)(1×106) 5-8F, 人高转移鼻咽癌细胞系 Human天狼猩红 Sirius Rose BB (Standard Fluka, for mi... 2829-43-8 5G 染色剂

豹猫肺成纤维样细胞;LCL4DMAPAA二甲基丙基酰胺100毫升BR，98%

GFRA3 Others Mouse 小鼠 GFRA3 / GFR-alpha-3 人细胞裂解液 (阳性对照) litxiumChloride 100g/500g Amresco分装
小鼠骨髓瘤细胞;P3/NSI/1-Ag4-1细胞弛素BCytochalasin B质量规格：>96%,进分

CHI3L1 Others Mouse 小鼠 CHI3L1 / YKL40 / gp39 人细胞裂解液 (阳性对照) 烟曲霉素Fumagillin from Aspergillus fumigatus质量规格：>98%,进分

Caco-2 人结直肠腺癌细胞寡霉素BOligomycin B from Streptomyces质量规格：>97%,进分

A498-EGFP-puro人肾癌细胞 Human renal cell carcinoma A498-EGFP-puro cells DMEM+10% FBS+1%P/S+2ug/ml puromycin棒曲霉素Patulin from Penicillium expansum质量规格：>98%,进口

GDF15 Protein Human 重组人 GDF-15 蛋白 (Fc 标签)3-溴二苯甲酮 3-Bromobenzophenone质量规格：>97%,
人口腔上皮癌细胞皮肤肥大细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)D-脯氨酸D-Proline质量规格：>98%,BR

EFNB1 Others Rat 大鼠 Ephrin-B1 / EFNB1 人细胞裂解液 (阳性对照) D-苯丙氨酸D-Phenylalanine 质量规格：>99%,BR

大鼠肾管状上皮细胞*培养基 100mLD-丙氨酸D-Alanine质量规格：>98%,BR

Y3-Ag 1.2.3大鼠骨髓瘤细胞 Myeloma cells in Y3-Ag 1.2.3 rats DMEM培养基+10%FBSβ-丙氨酸β-Alanine质量规格：>98%

IGFBP3 Protein Human 重组人 IGFBP3 / IBP3 蛋白 (His 标签)β-丙氨酸(标准品)β-Alanine质量规格：>98%(T),标准品
细胞接受后的处理：
1） 收到细胞后，请检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们。若发现污染或疑似污染，请及时与我们取得联系。
2） 请先在显微镜下确认细胞生长状态，去掉封口膜并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。
3） 弃去T25瓶中的培养基，添加6ml新的的*培养基。
4） 如果细胞长满（90%以上）请及时进行细胞传代。
5） 接到细胞次日，请检查细胞是否污染，